Blog

Jul 11, 2023

Die Kristallstruktur einer Rezeptorbindungsdomäne des Affen-Foamy-Virus liefert Hinweise auf den Eintritt in Wirtszellen

Band Nature Communications

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1262 (2023) Diesen Artikel zitieren

1843 Zugriffe

15 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Das Oberflächenhüllenglykoprotein (Env) aller Retroviren vermittelt die Virusbindung an Zellen und die Fusion der viralen und zellulären Membranen. Eine Struktur-Funktions-Beziehung für HIV Env, das zur Unterfamilie der Orthoretroviren gehört, ist gut etabliert. Für die Env der Foamy-Viren (FVs), der zweiten retroviralen Unterfamilie, fehlen jedoch weitgehend Strukturinformationen. In dieser Arbeit präsentieren wir die Röntgenstruktur der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) eines Affen-FV-Env mit einer Auflösung von 2,57 Å und zeigen zwei Subdomänen und eine beispiellose Faltung. Wir haben ein Modell für die Organisation der RBDs innerhalb des trimeren Env erstellt, das darauf hinweist, dass die oberen Subdomänen eine käfigartige Struktur an der Spitze des Env bilden, und haben die Reste K342, R343, R359 und R369 in der unteren Subdomäne als identifiziert Schlüsselakteure für die Wechselwirkung von RBD und Viruspartikeln mit Heparansulfat.

Spumaretroviren, auch bekannt als Foamy-Viren (FVs), sind alte Retroviren, die sich seit über 400 Millionen Jahren gemeinsam mit Wirbeltierwirten entwickelt haben1,2. FVs kommen häufig bei nichtmenschlichen Primaten vor, die sie auf den Menschen übertragen können, meist durch Bisse3. Im Gegensatz zu ihren besser untersuchten Orthoretrovirinae-Verwandten (HIV ist das bemerkenswerteste Mitglied) haben FVs extrem langsam mutierende Genome und lösen keine schweren Pathologien aus, obwohl sie sich in das Wirtsgenom integrieren und lebenslang anhaltende Infektionen hervorrufen4,5. Diese Merkmale sowie der breite Tropismus und das Wirtsspektrum6 machen FVs zu attraktiven Vektorkandidaten für die Gentherapie7.

Virale Fusionsproteine ​​treiben die Membranfusion durch eine Konformationsänderung voran, die durch Ansäuerung in einem endosomalen Kompartiment und/oder Bindung an einen spezifischen zellulären Rezeptor ausgelöst werden kann8,9. FVs dringen durch Endozytose in Zellen ein, wobei die Fusion der Virus- und Zellmembranen im endosomalen Kompartiment auf pH-empfindliche Weise erfolgt, was zur Freisetzung von Nukleokapsid in das Zytosol führt10. Eine Ausnahme bildet der Prototyp FV (PFV), der auch an der Plasmamembran fusionieren kann11. Das Glykoprotein der FV-Hülle (Env) gehört zu den Fusogenen der Klasse I12, die als einkettige Vorläufer synthetisiert werden, die sich zu Trimeren falten und deren Protomere anschließend im Golgi-Kompartiment während des Transports zur Zelloberfläche gespalten werden. FV Env wird während der Reifung an zwei Stellen durch zelluläres Furin gespalten, wodurch drei Fragmente entstehen: das Leaderpeptid (LP), die Oberflächenuntereinheit (SU), die die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) umfasst, und die Transmembranuntereinheit (TM). ), in dem sich die Fusionsmaschinerie befindet. Die für FV Env verfügbaren Strukturinformationen beschränken sich auf die Kryo-Elektronentomographie (ET) viraler Partikel und eine 9 Å Kryo-Elektronenmikroskopie (EM)-Rekonstruktion von PFV Env13, die LP-SU-TM-Trimere zeigte, die in ineinandergreifenden hexagonalen Anordnungen angeordnet sind13, 14, mit einer Architektur, die sich von der der HIV-Env-Trimere15 unterscheidet.

Heparansulfat (HS) ist ein Bindungsfaktor für PFV und felines FV16,17, aber die Anforderungen an einen Oberflächen- oder intrazellulären Rezeptor, der die Membranfusion durch FV-Env auslösen würde, bleiben unklar. Die Suche nach einem Rezeptor wurde durch die Bindung von FV an HS erschwert, das allgegenwärtig auf Zellen exprimiert wird und potenzielle Eintrittsrezeptorkandidaten maskiert. Eine zweiteilige RBD, bestehend aus zwei diskontinuierlichen Regionen der Polypeptidkette, wurde durch Screening einer Reihe rekombinanter SU-Verkürzungen auf Bindung an Zellen identifiziert18. Es wurde auch gezeigt, dass die RBD das Hauptziel neutralisierender Antikörper bei infizierten Menschen ist19,20.

FV Env ist stark glykosyliert, mit mindestens 13 vorhergesagten N-verknüpften Glykosylierungsstellen. Mutationsanalysen haben ergeben, dass drei dieser N-Stellen für die PFV-Infektiosität essentiell sind – zwei befinden sich in der TM-Untereinheit und eine in der RBD. Die letztere Stelle, die als Glykosylierungsstelle 8 oder N821 bezeichnet wird, ist in der gesamten FV-Unterfamilie konserviert und spielt vermutlich eine direkte Rolle bei der Bindung an einen Rezeptor18 (zur Unterscheidung der Nomenklatur der vorhergesagten N-verknüpften Glykosylierungsstellen (N1 bis). (N15) aus dem Einzelbuchstabensymbol für Asparagin (N; ersteres wird im gesamten Text unterstrichen). Die verbleibenden molekularen Determinanten der RBD-Wechselwirkung mit Wirtszellen sind weiterhin unklar, was vor allem auf den Mangel an Strukturinformationen zurückzuführen ist, der rationale Ansätze zur Mutagenese und Funktionsanalysen ausgeschlossen hat. Eine hochauflösende Struktur der FV-RBD, Strukturinformationen zur Organisation der RBDs innerhalb des Env-Trimers und wie die RBDs zur Env-Aktivierung beitragen, sind nicht verfügbar.

In diesem Manuskript präsentieren wir die Röntgenstruktur der RBD eines zoonotischen Gorilla-FV mit einer Auflösung von 2,57 Å, die eine neuartige Faltung offenbart. Durch Andocken eines starren Körpers an die verfügbare Kryo-ET-Rekonstruktion eines PFV-Env-Trimers13 leiteten wir ein Modell für die RBD-Organisation im Env ab und identifizierten Reste, die an der HS-Bindung beteiligt sind, wobei funktionelle und evolutionäre Implikationen diskutiert wurden. Strukturelle Kenntnisse über die FV-RBD sind von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Virus-Zell-Wechselwirkungen, dem ersten Schritt, der Env dazu veranlasst, die Membranfusion zu vermitteln, und für Einblicke in die Antikörper-vermittelte Neutralisierung durch menschliche Wirte. Unsere Daten bieten einen Rahmen für rationale strukturgesteuerte Mutagenesestudien, die für die Erkennung der molekularen Grundlagen verschiedener Schritte des FV-Eintritts in Wirtszellen erforderlich sind.

Rekombinante RBDs aus mehreren Affen-FV-Stämmen (SFV) wurden auf Produktion in Drosophila-S2-Insektenzellen getestet, und nur die RBD aus Gorilla-SFV (Stamm SFVggo_huBAK7422, Genotyp II; hier als „GII“ abgekürzt) wurde in ausreichend hohen Ausbeuten exprimiert und bildete Kristalle . Es wurde erwartet, dass die RBD aufgrund von 8 vorhergesagten N-Glykosylierungsstellen stark glykosyliert ist (Abb. 1a). Um die Chancen auf die Bildung gut beugender Kristalle zu erhöhen, wurde ein Teil des gereinigten Proteins mit den Endoglykosidasen H und D enzymatisch deglykosyliert (RBDD), wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. Kristalle wurden sowohl für das RBDD als auch für das unbehandelte Protein (RBDG) erhalten. Das RBDD beugte besser (2,57 Å) als das RBDG (2,80 Å) und die unten dargestellten Strukturanalysen wurden unter Verwendung der RBDD-Struktur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die Statistiken zur Datenerfassung und Strukturbestimmung für beide Kristallformen sind in Tabelle S1 zusammengefasst.

a Schematische Darstellung der SFV-Env-Proteinorganisation mit Angabe der drei konstituierenden Ketten: Leaderpeptid (LP), Oberflächenuntereinheit (SU) und Transmembranuntereinheit (TM). Die Transmembrandomänen, die LP und TM in der Membran verankern, werden als schwarze Kästchen dargestellt; die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) innerhalb von SU ist im blau-roten Spektrum hervorgehoben; Das Fusionspeptid am N-Terminus des TM ist blau dargestellt. Die Furinstellen zwischen LP und SU (RIAR126) sowie SU und TM (RRKR570) sind mit Scherensymbolen gekennzeichnet. Das RBD-Expressionskonstrukt enthielt das exogene BiP-Signal am N-Terminus, die Reste 218 bis 552 des SFV-Gorilla-GII-Env und einen doppelten Strep-Tag am C-Terminus (dargestellt als zwei Kreise). Der Bereich mit den Resten 420–426 ist als gestrichelte Linie dargestellt, da er in der Elektronendichtekarte nicht zu sehen war. Die 17 mutmaßlichen N-Glykosylierungsstellen für Gorilla SFV Env sind mit Sternsymbolen gekennzeichnet und mit N1 bis N15 gekennzeichnet, entsprechend der zuvor festgelegten Nomenklatur22. b Die Röntgenstruktur des RBDD wird im Bandmodell dargestellt, das vom N- bis zum C-Terminus jeweils im blauen bis roten Spektrum gefärbt ist. Die gestrichelte Linie zeigt die Trennung zwischen der oberen und unteren Subdomäne. Die N-Glykosylierungsstellen sind mit N gekennzeichnet, und die Zucker und die sie tragenden Asparaginseitenketten sind als Stäbchen dargestellt. Die Figur wurde mit Pymol65 erstellt. c Lineare Darstellung der RBD. Die 8 N-Glykosylierungsstellen mit in die Elektronendichte eingebauten Zuckern werden als graue Sterne angezeigt, einschließlich der Stelle N10 (N411), die die Dichte für ein angehängtes Kohlenhydrat in RBDG (Molekül B), aber nicht in RBDD zeigte. Standort N8 (N390), der eine lange, teilweise verborgene Zuckereinheit enthält, ist durch eine dickere Umrandung hervorgehoben. Die Positionen von sechs Disulfiden sind wie in Tafel b mit nummerierten gelben Kreisen gekennzeichnet. Die Figur wurde in BioRender.com erstellt.

Die SFV-RBD faltet sich in zwei Subdomänen mit jeweils α + β-Topologie, die wir als „untere“ (Reste 218–245, 311–369 und 491–524) und „obere“ Subdomänen (Reste 246–310 und 370) bezeichnen –490) in Bezug auf ihre Positionierung in Bezug auf die Virusmembran13 (siehe unten). Das RBD hat eine zweilappige, bohnenartige Form mit einer längsten Abmessung von ~65 Å. Die obere Subdomäne bildet einen breiteren (~45 Å Durchmesser) und die N- und C-Termini einen schmalen Lappen (~20 Å Durchmesser), der auch als untere Subdomäne bezeichnet wird (Abb. 1b). Die untere Subdomäne besteht aus einem Drei-Helix-Bündel (α1, α7, α8), das gegen ein antiparalleles, verdrilltes viersträngiges β-Faltblatt (β14-β1-β5-β15) und gegen die Helix α2 (Reste 333–346) gepackt ist. das senkrecht auf der Seite des Bündels liegt. Innerhalb des Helixbündels und des β-Faltblatts sind die Regionen in der Nähe der N- und C-Termini durch Disulfidbindungen (DS) DS1 (C228–C503) bzw. DS2 (C235–C318) miteinander verbunden. Die obere Subdomäne wird durch zwei lange Exkursionen aus der unteren Subdomäne gebildet: ~70 Reste verbinden die Stränge β1 und β5 und ~130 Reste verbinden η4 und β14 (Abb. 2). Die Polypeptidkette erstreckt sich somit zweimal nach oben und hinten und bildet am Ende die äußeren Stränge (β14 und β15) des β-Faltblatts der unteren Subdomäne. Diese sekundären Strukturelemente in der unteren Subdomäne umfassen einen markanten hydrophoben Kern, der sich in die obere Subdomäne erstreckt, einen geringeren Sekundärstrukturgehalt aufweist (Tabelle S2) und durch mehrere Netzwerke polarer Wechselwirkungen stabilisiert wird (Abb. S1 und Tabelle S3). Vier bemerkenswerte Vorsprünge, die als Schleifen 1 bis 4 (L1–L4) bezeichnet werden, gehen von der oberen Domäne aus: Schleife 1 (L1, Reste 253–270, verbindet β2 und η1), Schleife 2 (L2, Reste 276–281, verbindet η1 und β3 ), Schleife 3 (L3, Reste 414–436, verbindet α5 und β9) und Schleife 4 (L4, Reste 446–453, verbindet β10 und β11). Die Schleifen L3 und L4 sind in unseren Strukturen besonders mobil, was durch hohe B-Faktoren (>105 Å2) für ihre Cα-Atome angezeigt wird (Abb. S2). Die Elektronendichte wurde für die 8 vorhergesagten N-Glykosylierungsstellen beobachtet (Abb. 1c), was die Modellierung von mindestens einem N-Acetylglucosamin (NAG) an jeder Stelle ermöglichte (Abb. 2 und Abb. S3a).

Die horizontale gestrichelte Linie markiert die Grenze zwischen der unteren und oberen Subdomäne. Die NAG- und MAN-Einheiten, die nur in die RBDG-Struktur (und nicht in die RBDD-Struktur) eingebaut sind, sind mit roten Rahmen gekennzeichnet. Die Figur wurde mit BioRender.com erstellt.

Die Suche in der PDB-Datenbank mit dem DALI-Algorithmus23, mit der RBD und ihren Unterstrukturen als Abfragen, ergab keine aussagekräftigen Ergebnisse. Vergleichsanalysen mit den verfügbaren Strukturen der RBDs von Orthoretroviren (Abb. S4) ergaben keine strukturelle Ähnlichkeit, weder auf der Ebene der Sekundärstrukturtopologie noch der dreidimensionalen Faltung. Daher stellt der SFV RBD nach unserem besten Wissen eine beispiellose Falte dar.

Es gab keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Röntgenstrukturen von RBDD und RBDG (ihre Überlagerung ergab eine mittlere quadratische Abweichung (rmsd) von weniger als 1 Å (Abb. S3b, c), mit Ausnahme der unterschiedlichen Anzahl von Zuckereinheiten, die wir bilden konnten in die Elektronendichtekarten (Abb. S3a). Ein herausragendes Merkmal der oberen Subdomäne ist der achte N-verknüpfte Zucker (N8)18, der an den α4-Helixrest N390 gebunden ist. Die N390-Seitenkette und die ersten beiden gebundenen NAG-Reste sind verborgen im RBD, wodurch die EndoH/D-Spaltungsstelle unzugänglich wurde (Abb. 3b), was den Aufbau von 10 Zuckerresten in RBDG und 8 in den deglykosylierten Proteinkristallen ermöglichte (Abb. 2 und 3). Das N8-Glykan tritt aus einem Hohlraum aus, der dies getan hat N390 an seiner Basis und erstreckt sich nach oben, bleibt in Kontakt mit dem Protein und behält die gleiche Konformation in beiden Kristallformen bei. Strukturanalysen ergaben, dass das Glykan ausgedehnte Van-der-Waal-Kontakte mit den Resten darunter (vergrabene Oberfläche von 803 Å2) eingeht und sich bildet Wasserstoffbrückenbindungen mit Hauptkettenatomen von Y394 und I484 und der Seitenkette von E361 (Abb. S5). Die Glykaneinheit bedeckt eine gut konservierte und hydrophobe Oberfläche (Abb. 3a, b) und erhält so die RBD-Faltung aufrecht und verhindert die Aggregation, was mit der berichteten Fehlfaltung und den geringen Mengen an sekretiertem PFV SU mit einer Mutation an der N8-Stelle übereinstimmt18. N8 ist die einzige N-Glykosylierungsstelle in SU, die in der gesamten FV-Unterfamilie streng konserviert ist (Abb. S6), und die darunter liegenden hydrophoben Patch-Reste sind ebenfalls konserviert (Abb. 3c). Daher spielt N8 wahrscheinlich eine wichtige strukturelle Rolle in allen FV-RBDs.

a Molekulare Oberflächendarstellung des SFV-RBD, gefärbt durch Resthydrophobie. Die Hydrophobie für jeden Rest wurde gemäß der Kyte- und Doolittle-Skala66 in Chimera29 berechnet, wobei der Farbverlaufsschlüssel die niedrigste Hydrophobie in Blau bis zur höchsten Hydrophobie in Gelb angibt. Die Zucker an den Standorten N6, N7, N7' und N9 werden als weiße Stäbchen dargestellt und der an N8 gebundene Zucker als cyanfarbene Stäbchen. Der Einlass zeigt die durch die Glykosidasen Endo D/H gespaltene Bindung, die in N8 geschützt ist. b Der an N390 gebundene N8-Zucker bedeckt einen hydrophoben Bereich. Der vergrößerte Bereich innerhalb des gestrichelten Rechtecks ​​in Bild a wird angezeigt. Die NAG- und MAN-Reste sind mit Nummern gekennzeichnet, die dem N-Oligosaccharid entsprechen, das im Einlass von Tafel a dargestellt ist. c Der von N8 bedeckte hydrophobe Bereich ist gut konserviert. Die SFV-RBD-Oberfläche wird durch Restekonservierung in Chimera29 entsprechend dem Prozentsatz der identischen Reste in den 11 FV-Env-Sequenzen gerendert (Ausrichtung in Abb. S6 dargestellt). Reste, die in weniger als 30 % und mehr als 90 % der Sequenzen konserviert sind, sind weiß bzw. violett gefärbt, und Reste dazwischen weisen einen weiß-violetten Farbverlauf auf, wie auf dem Farbschlüssel unter der Oberflächendarstellung angegeben.

Um mögliche Konformationsunterschiede zwischen RBDs verschiedener Arten zu untersuchen, verwendeten wir die Software AlphaFold 2 (AF2)24 für die Ab-initio-Vorhersage der RBD-Strukturen von Mitgliedern jeder der 5 FV-Gattungen, von denen einige aufgrund der modularen Natur als zwei Genotypen existieren von FV Env25. Innerhalb jedes FV-Env definiert eine etwa 250 Reste lange Region innerhalb der RBD, die als Variable oder „SUvar“ bezeichnet wird, zwei gemeinsam zirkulierende Genotypen, I und II, die unter anderem bei Gorillas26, Schimpansen19 und Mandrills25 gefunden wurden. Die SUvar-Regionen weisen eine Aminosäuresequenzidentität von weniger als 70 % auf (Abb. S6), während der Rest der Env-Reste hoch konserviert ist (> 95 % Sequenzidentität). Die SUvar befindet sich in der oberen Subdomäne und umfasst die Schleifen L1–L4 (Reste 282–487 in GII RBD; Abb. S6 und S7).

Alle generierten AF2-Modelle verfügen über Metriken mit hoher Zuverlässigkeit (Abb. S8) und zeigen eine konservierte Faltung in Übereinstimmung mit einer Aminosäuresequenzidentität von > 30 %. Signifikante Abweichungen wurden nur in den Schleifen innerhalb der SUvar gefunden. Der Template Modeling Score (TM-Score), der im Gegensatz zum RMSD ein längenunabhängiges Maß für strukturelle Ähnlichkeit27 ist, hat für die 11 verglichenen Strukturen einen Durchschnittswert von 0,89. Das AF2-Modell der GII-RBD und unsere experimentell bestimmte Struktur derselben Belastung überlagern sich mit einem TM-Score von 0,96 und einem RMSD von 1,5 Å für 320 von 328 ausgerichteten Cα-Atomen, was die hohe Genauigkeit des AF2-Modells bestätigt. Ein „gemeinsamer Kern“ (CC), der das Ensemble von Resten mit Cα-rmsd-Werten kleiner als 4 Å für alle paarweisen Überlagerungen umfasst, wurde vom mTM-align-Webserver28 berechnet. Der CC der FV-RBD enthält 239 von 308 ausgerichteten Resten (Abb. S9a), wobei die meisten CC-Reste zu den Sekundärstrukturelementen gehören, die die untere Subdomäne bilden. Die Schleifen in der oberen Subdomäne sind größtenteils nicht Teil des CC (Abb. S9).

Um die RBD-Anordnung im trimeren Env zu untersuchen, haben wir das RBD-Atommodell in die 9-Å-Kryo-EM-Karte eingepasst, die für trimeres PFV (ein FV des Schimpansen-Genotyps I) berichtet wurde, das auf Foamy-Virusvektorpartikeln (FVV) exprimiert wird . Die Anpassung wurde durch die hohe strukturelle Erhaltung zwischen Gorilla- und Schimpansen-RBDs gerechtfertigt, was durch einen TM-Score von 0,88 für die Überlagerung der GII-RBD-Struktur und des vorhergesagten PFV-RBD-Modells angezeigt wird (Abb. S8).

Die RBD-Anpassung wurde mit der Fit-in-Map-Funktion in Chimera suite29 (Abb. 4a) durchgeführt, wie in Material und Methoden beschrieben. Der Korrelationskoeffizient von 0,96 deutet stark darauf hin, dass das rekombinant exprimierte RBD seine biologisch relevante Konformation darstellt, wie sie auf der Oberfläche von Viruspartikeln beobachtet wird. Die 7 N-verknüpften Glykane, die wir in der RBDD-Struktur auflösen konnten, sind alle vollständig lösungsmittelexponiert (Abb. 4b), und in der PFV-EM-Karte wurde eine zusätzliche Dichte für die an N5, N6, N7, N8 und N9 gebundenen Zucker beobachtet und N11, was die RBD-Platzierungen bestätigt (die N7'-Stelle fehlt in PFV Env und an dieser Stelle wurde keine zusätzliche Dichte beobachtet). Die RBD-N- und C-Termini zeigen zur Membran, was darauf hindeutet, dass die untere Hälfte der Env-Dichte von der TM-Untereinheit und den verbleibenden SU-Resten besetzt ist, wie bereits vermutet13.

a Drei SFV-RBDD-Protomere wurden in die 9-Å-Kryo-EM-Karte (EMBD: 4013) eingepasst, die durch Kryo-EM-3D-Rekonstruktion des auf viralen Vektorpartikeln exprimierten PFV-Env in voller Länge erhalten wurde13. Die Karte wird in hellgrauer Oberfläche und die RBDs im Cartoon-Modus angezeigt, wobei jedes Protomer eine andere Farbe hat (gelb, weiß, hellblau). b Die drei RBDs, angepasst wie in Tafel a erklärt, werden gezeigt, um zu veranschaulichen, dass die α2- und η4-Helices, die die HS-bindenden Reste (K342, R343, R359, R369) tragen, und die N-verknüpften Glykosylierungen (N6, N7 , N7', N8, N9 und N11) zeigen nach außen und sind lösungsmittelzugänglich. Der umrahmte Bereich auf der linken Seite wird vergrößert und auf der rechten Seite angezeigt (aus Gründen der Übersichtlichkeit ist nur ein Protomer in Weiß dargestellt). c Dargestellt sind die Ansichten der trimeren RBD-Anordnung von oben, also mit Blick auf die Membran (links), und von unten, also mit Blick von der Membran (rechts). Die RBDs bilden Interprotomer-Kontakte über L1-L4 in der oberen Domäne. Die zu jedem Protomer gehörenden Schleifen werden als L, L' und L bezeichnet. Bilder wurden in Chimera29 erstellt.

Die drei angepassten RBDs sind um einen zentralen Hohlraum an der Spitze (membrandistaler Bereich) von Env angeordnet (Abb. 4a). Die in PDBePISA30 durchgeführten Analysen der makromolekularen Oberflächen des trimeren RBD-Modells ergaben eine begrenzte Interprotomer-Schnittstelle (<10 % der gesamten lösungsmittelzugänglichen RBD-Oberfläche), die durch Schleifen L1–L4 gebildet wird, die an der RBD eine ringartige Struktur bilden Scheitelpunkt, so dass der größte Teil der RBD freiliegt (Abb. 4b). Dem Modell zufolge nehmen die drei L1-Schleifen wahrscheinlich an homotypischen Wechselwirkungen im Zentrum der RBD teil und bilden einen inneren Ring, während jede L3-Schleife L4 und L2 eines benachbarten Protomers kontaktiert. Die Reste an der Schnittstelle der angedockten Modelle, die möglicherweise nichtkovalente Kontakte bilden könnten (Abb. S10b, c) und die Länge der Schleifenregionen (Abb. S9a und S10a), sind in der gesamten FV-Familie schlecht konserviert. Es ist wichtig zu beachten, dass die Untereinheiten von PFV Env TM trimerisieren und ein markantes zentrales Coiled-Coil13 bilden, ein Kennzeichen aller Klasse-I-Fusionsproteine. Somit wären die potenziellen Schnittstellen zwischen den RBDs nur eine der beitragenden Env-Trimerisierungsstellen.

Um die Bedeutung der Schleifen für die Env-Funktion zu beurteilen, haben wir FVVs generiert, die GII Env mit Deletionen der Schleifen L2 und L4 (ΔL2 bzw. ΔL4) tragen. Die Menge der sekretierten mutierten FVV-Partikel war um mehr als das 50-fache reduziert (Abb. S11a) und ihre Bindung an Zellen war im Vergleich zu den FVVs mit WT-Env um das 2- bis 4-fache verringert (Abb. S11a). Die Infektiosität beider Mutanten lag jedoch unter der Nachweisgrenze unseres Tests (Abb. S11c, d), was darauf hindeutet, dass die Schleifen L2 und L4 trotz schlechter Sequenzkonservierung eine relevante strukturelle und/oder funktionelle Rolle für die Aktivität von Env spielen.

Um potenzielle HS-Bindungsregionen in der RBD zu lokalisieren, untersuchten wir die Oberflächenverteilung des elektrostatischen Potentials und identifizierten einen großen, kontinuierlichen Oberflächenfleck in der unteren Subdomäne mit einem stark positiven Potential (Abb. 5a). Als nächstes analysierten wir die RBD-Struktur mit dem ClusPro-Server, der mutmaßliche HS-Bindungsstellen durch Andocken eines HS-Tetrasaccharids an die Proteinoberfläche vorhersagt. K342 und R343 in der Helix α2, R359 in der vorangehenden Helix η4 und R369 in einer erweiterten Kettenregion gehörten zu den Resten, die die meisten Kontakte mit den an die Oberfläche angedockten HS-Modellen aufwiesen (Abb. 5b, c). Die vier Reste wurden auch innerhalb der positiv geladenen Region in der unteren Subdomäne kartiert.

Eine Verteilung des elektrostatischen Potentials wurde mithilfe des Adaptive Poisson-Boltzmann Solver-Moduls67 in Pymol65 berechnet und auf der lösungsmittelfreien Oberfläche des RBD aufgetragen, wobei Rot dem negativen und Blau dem positiven Potential entspricht (zwei linke Felder). Das von ClusPro31 modellierte Ensemble der HS-Moleküle ist der unteren Subdomäne zugeordnet und wird in Stäben auf den beiden rechten Feldern angezeigt. Die RBD wird im Cartoon-Modell und in zwei Ausrichtungen dargestellt, um die Position der vorhergesagten HS-bindenden Sekundärstrukturelemente zu veranschaulichen. b Voraussichtliche Anzahl von Kontakten pro Rest und pro Seitenkettenatom, berechnet von ClusPro und aufgezeichnet für jeden RBD-Rest, was die wahrscheinlichsten Kandidaten zeigt, die an der HS-Bindung beteiligt sind. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c Die Struktur von RBD ist im Cartoon dargestellt, wobei die Region, die α2- und η4-Helices enthält, grau hervorgehoben ist. Die Vergrößerung des grau eingerahmten Bereichs wird auf der rechten Seite angezeigt, wobei die relevanten Sekundärstrukturelemente und vorhergesagten HS-bindenden Reste in Stäbchen dargestellt sind. Zwei Disulfidbindungen sind durch gelbe Kreise gekennzeichnet. Die Figur wurde mit Pymol65 und BioRender.com erstellt.

Basierend auf den ClusPro-Vorhersagen produzierten wir zwei GII-RBD-Varianten (K342/R343, bezeichnet als „mut1“ und R359/R369, bezeichnet als „mut2“) und testeten ihre Bindung an HS, das auf einer Sepharose-Matrix immobilisiert war (Abb. 6a). Die beiden RBD-Varianten eluierten bei der Größenausschlusschromatographie im gleichen Volumen, was mit der erwarteten Größe eines Monomers übereinstimmte (Abb. S12), was darauf hinweist, dass die eingeführten Mutationen keine Proteinfehlfaltung verursachten. Das WT-RBD wurde auf der Heparinsäule zurückgehalten und bei einer Natriumchloridkonzentration von 300 mM eluiert, während die mut1- und mut2-Varianten nicht in der Durchflussfraktion zurückgehalten und eluiert wurden. Der beobachtete Verlust der Heparinbindungskapazität deutet stark darauf hin, dass die Reste K342, K343, R359 und R369 direkt an Wechselwirkungen mit HS beteiligt sind.

ein Heparin-Sepharose-Chromatogramm des rekombinanten SFV RBD, WT (rot) und Varianten mit Mutationen in HS-bindenden Resten, mut1 (K342A/R343A) in Blau und mut2 (R356A/R369A) in Grün. Die gepunktete Linie zeigt die Salzkonzentration an, aufgetragen auf der rechten Y-Achse. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. b Bindung rekombinanter WT-RBD- und Env-Ektodomänen an HT1080-Zellen. Die SFV-RBD- und Ektodomänenbindungsniveaus wurden als Verhältnis von MFI aus mit Protein behandelten zu unbehandelten Zellen ausgedrückt. Um mit der RBD vergleichbar zu sein, wird die Konzentration für die Ektodomäne berechnet und für das Monomerprotein aufgetragen. Die Gating-Strategie ist in (Abb. S13a) dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c Bindung der rekombinanten Env-Ektodomänen WT, mut1 (K342A/R343A) und mut2 (R356A/R369A) an HT1080- und BHK-21-Zellen. Das SFV-Env-Bindungsniveau an lebende Einzelzellen wurde als Verhältnis von MFI aus mit Protein behandelten zu unbehandelten Zellen ausgedrückt (Abb. S13b). Dargestellt sind Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten. Die Zell-HS-Expressionsniveaus wurden am Tag jedes der beiden Experimente überwacht (die HS-Färbungsniveaus betrugen 85,4 und 61,6 für HT1080-Zellen, 8,40 und 2,68 für BHK-21-Zellen (Abb. S13c)). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. d Die Bindung der rekombinanten Env-Ektodomänen WT, mut1 (K342A/R343A) und mut2 (R356A/R369A) an mit Heparinase oder Puffer behandelte HT1080-Zellen wurde bei steigenden Ektodomänenkonzentrationen quantifiziert. Der Bindungsgrad der Ektodomäne an lebende Einzelzellen wurde als Verhältnis des MFI von mit Protein behandelten zu unbehandelten Zellen ausgedrückt (Abb. S13b). Dargestellt sind Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten. Die Expression und Entfernung der HS-Oberfläche wurde durch HS- und ΔHS-spezifische Antikörper quantifiziert (Abb. S13d). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. e Es wurden fünf Chargen von FVVs mit den Envs WT (rot), mut1 (blau) und mut2 (grün) hergestellt. Jede Charge wird durch einen einzelnen Punkt dargestellt; Die schwarzen Linien geben die Mittelwerte an. Der Prozentsatz infektiöser FVV-Partikel, die WT, mut1 oder mut2 Env tragen, wurde als Verhältnis zwischen der Anzahl infektiöser Partikel (bestimmt durch Titration an anfälligen Zellen, Abb. S14a) und der Menge an Vektorpartikeln, die durch RT-qPCR erhalten wurden (Abb. S14b). Die mutierten FVVs wurden mit den WT-FVVs unter Verwendung des zweifach gepaarten t-Tests verglichen, wobei die p-Werte in der Grafik angegeben waren. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. f Bindung von FVVs, die das WT-, mut1- oder mut2-Env tragen, an HT1080-Zellen. Drei Chargen von FVVs wurden mit HT1080-Zellen auf Eis 1 Stunde lang bei unterschiedlichen Partikelzahl/Zell-Verhältnissen inkubiert, bevor die verbleibenden Vektorpartikel durch RT-qPCR gewaschen und quantifiziert wurden. Die gepunktete Linie stellt die Quantifizierungsschwelle dar. Die FVVs, die die Mutante und WT-Envs trugen, wurden mithilfe des zweifach gepaarten t-Tests verglichen, wobei die p-Werte in der Grafik angegeben sind. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir verwendeten Durchflusszytometrie, um die Wechselwirkung zwischen GII RBD und HS auf Zellen zu untersuchen (Abb. S13a). Wir fanden heraus, dass das monomere RBD selbst bei hohen Proteinkonzentrationen nicht an HT1080-Zellen bindet (Abb. 6b). Wir testeten daher ein längeres Konstrukt, die GII-Env-Ektodomäne, die spontan Trimer bildet, und gingen davon aus, dass ein Oligomer aufgrund von Aviditätseffekten ein höheres Signal liefern würde. Die trimere Ektodomäne band an HT1080-Zellen (Abb. 6b), daher wurden die Mutationen K342A/R343A und R356A/R369A (mut1 bzw. mut2) in den Hintergrund der Ektodomäne eingeführt, um sie für Durchflusszytometrie-Experimente geeignet zu machen. Wir verglichen die Bindung der Env-Ektodomänen an HT1080- und BHK-21-Zellen (Abb. 6c), die beide anfällig für eine Infektion durch Gorilla-FVs sind. Wir haben die HS-Expressionsniveaus durch Durchflusszytometrie gleichzeitig mit den Bindungsexperimenten quantifiziert und bestätigt, dass BHK-21-Zellen niedrigere HS-Niveaus exprimierten als HT1080-Zellen, wie berichtet17 (Abb. S13c). Die HS-Expressionsniveaus waren auf BHK-21-Zellen im Vergleich zu HT1080-Zellen 10- bis 30-fach niedriger (Abb. 6c) und die Bindung der WT-Ektodomäne an BHK-21-Zellen war bei den höchsten getesteten Proteinkonzentrationen geringer als an HT1080-Zellen. Das Bindungssignal war dosisabhängig und für mut1- und mut2-Ektodomänenvarianten im Vergleich zum WT-Protein auf beiden Zelllinien um einen Log niedriger (Abb. 6c).

Um zu beweisen, dass die entworfenen Mutationen spezifisch die Interaktion mit zellulärem HS beeinflussen, haben wir die Bindung an HT1080-Zellen gemessen, die mit Heparinase vorbehandelt wurden, wodurch mehr als 90 % des HS aus den Zellen entfernt wurden (Abb. S13d). Die Bindung der WT-Ektodomäne an mit Heparinase behandelte Zellen war im Vergleich zu mit Puffer behandelten Zellen etwa 100-fach verringert, während die Mut1- und Mut2-Varianten unabhängig von der Heparinase-Behandlung nicht banden (Abb. 6d).

Die Bedeutung der Reste K342, R343, R356, R369 für die Virusbindung an HS wurde mit FVVs getestet, die entweder WT, mut1 oder mut2 Env auf ihrer Oberfläche exprimieren. Die Gesamtzahl der von den transfizierten Zellen freigesetzten FVV-Partikel, gemessen durch RT-qPCR, war für mut1 im Vergleich zu WT-FVVs etwa 6-fach niedriger, während mut2 die gleiche Partikelproduktion wie WT aufwies (Abb. S14a). Die Infektionstiter waren für mut1 und mut2 um das 34- bzw. 65-fache niedriger als bei WT (Abb. S14b). Der Anteil infektiöser Partikel, der Infektionstiter (Abb. S14b), dividiert durch die Gesamtzahl der FVVs (Abb. S14a), betrug 0,7 % für WT-Env-FVVs, während die Werte für mut1- und mut2-FVVs das 3- bzw. 22-fache betrugen niedriger (Abb. 6e). Wir haben die Bindung von FVVs an Zellen mittels RT-qPCR gemessen und festgestellt, dass die Bindung für FVVs, die mut1- bzw. mut2-Envs tragen, im Vergleich zu den WT-Env-FVVs ebenfalls um das 3- bzw. 23-fache verringert war (Abb. 6f). Somit waren die Bindung an Zellen und die Eintrittsniveaus bei den FVVs, die Env-Proteine ​​mit Mutationen in der HS-Bindungsstelle trugen, im gleichen Maße verringert.

Die für die rekombinanten Env-Proteine ​​(Abb. 6c, d) und FVVs, die Env in voller Länge tragen (Abb. 6f), beschriebenen Ergebnisse stimmen mit den biochemischen Daten (Abb. 6a) überein und zeigen, dass die Reste K342, R343, R356, R369 eine Rolle spielen entscheidende Rolle bei der Virusinteraktion mit HS.

Wir bestimmten die Röntgenstruktur des RBD eines Gorilla-FV und zeigten eine dreidimensionale Falte (Abb. 1 und 2), die sich von den verfügbaren RBD-Strukturen des Orthoretrovirus unterscheidet, d. h. RBD des murinen Friend-Leukämievirus, des felinen Leukämievirus und des Menschen endogenes Retrovirus EnvP(b)1 (Gammaretrovirus-Gattung)32,33,34 und gp120 von HIV35 (Lentivirus-Gattung) (Abb. S4). Dieser Befund erweitert das Repertoire einzigartiger FV-Merkmale (Assemblierung, Partikelfreisetzung36, Replikation37), die nicht mit Orthoretroviren gemeinsam sind, und ist angesichts der fehlenden Env-Sequenzkonservierung zwischen den Unterfamilien Orthoretrovirinae und Spumaretrovirinae nicht überraschend.

Für die RBDs einiger Orthoretroviren sind Strukturinformationen verfügbar. Im Fall der Gammaretroviren ist die RBD relativ klein (∼200 Reste) und faltet sich zu einem antiparallelen β-Sandwich mit zwei ausgedehnten Schleifen, die zu einer helikalen Subdomäne führen, die auf dem β-Sandwich sitzt33 (Abb. S4) . Die helikale Subdomäne definiert den Tropismus für zelluläre Rezeptoren38 und zeigt eine hohe Sequenzvariabilität innerhalb der Gattung. Im Gegensatz dazu haben Lentiviren wie HIV eine größere Rezeptorbindungsregion (ca. 450 Reste), die den größten Teil der SU-Untereinheit mit der Bezeichnung gp120 umfasst. HIV interagiert mit seinem verwandten Rezeptor CD4 über gp120, das in zwei Subdomänen, eine innere und eine äußere, gefaltet ist, wobei die Rezeptorbindungsoberfläche durch Sekundärstrukturelemente beider Subdomänen gebildet wird35. Variable Schleifen, die aus dem gp120-Kern herausragen, sind an der Rezeptorbindung und der Immunumgehung39 beteiligt und spielen eine Schlüsselrolle in der Env-Konformationsdynamik. Diese Env-Atmung bringt unterschiedliche Anordnungen der gp120-Untereinheiten und der Schleifen mit sich: die geschlossene (bei der die Schleifen Kontakte bilden), die entspannte (mit einem größeren Grad an Offenheit) und die offene (die nach der Bindung an den CD4-Rezeptor erreicht wird)40. 41. Wenn man die RBD von Orthoretroviren mit der von FVs vergleicht, kann man argumentieren, dass die globale Organisation der FV-RBD in zwei Subdomänen – die untere, die besser konserviert ist, und die obere, die die hervorstehenden Schleifen enthält und in der Reihenfolge variabel ist – an die RBD erinnert der oben für die RBDs von Orthoretroviren beschriebenen Merkmale. Ob das Vorhandensein ähnlicher Merkmale in HIV- und FV-Env-SUs eine ähnliche Funktion der Schleifen bei der Rezeptorbindung und Konformationsflexibilität impliziert, muss noch ermittelt werden.

Wir haben die experimentell bestimmte RBD-Struktur in die Karte mit niedriger Auflösung (Abb. 4a) eingepasst, die durch Kryo-EM-Einzelpartikelrekonstruktion von trimerem PFV-Env, ausgedrückt auf FVV-Partikeln, erhalten wurde. Das resultierende Modell der RBD-trimeren Anordnung stimmt mit den hier präsentierten biochemischen und funktionellen Daten überein, d zum Lösungsmittel (Abb. 4c). Nach unserem Modell liegen die L1-L4-Schleifen, die sich an der Spitze der oberen Subdomäne jedes Protomers befinden, nahe beieinander (Abb. 4) und hinterlassen direkt darunter einen Hohlraum, der im Kryo deutlich sichtbar war. EM-Karten13. Basierend auf diesen Beobachtungen haben wir spekuliert, dass die Interprotomer-Wechselwirkungen an der Aufrechterhaltung einer Env-Konformation vor der Fusion beteiligt sind. Wir testeten FVVs, die Env-Varianten mit Deletionen in den Schleifen L2 und L4 trugen (Abb. S11) und zeigten, dass diese Veränderungen die FVV-Bindung an Zellen geringfügig beeinflussten, aber zum vollständigen Verlust der Infektiosität führten, was die Möglichkeit bestätigt, dass die Envs Schleifendeletionen aufwiesen kann leicht in die fusionsinaktive Postfusionskonformation übergehen.

Die Schleifensequenzen sind in der gesamten FV-Familie schlecht konserviert und weisen variable Längen auf (Abb. S9 und S10a). Die Überlagerungen der AF2-Modelle von 11 FV-RBDs zeigten leichte strukturelle Unterschiede, die auf die variable Region mit den Schleifen beschränkt waren (Abb. S8 und S9). Eine schlechte Konservierung der Reste an der Grenzfläche zwischen RBDs im trimeren Env deutet auf einen schwachen Selektionsdruck hin und könnte darauf hinweisen, dass der native Env-Zustand auf verschiedenen Sätzen interagierender Schleifenreste in verschiedenen FVs beruht. Alternativ könnte die RBD-RBD-Grenzfläche polare Wechselwirkungen zwischen Hauptkettenatomen beinhalten, obwohl wir nicht erwarten würden, dass diese zahlreich sind, wenn man bedenkt, dass nur eine kleine Oberfläche der RBD an der Grenzfläche vergraben ist. Der Vorteil locker gebundener RBDs besteht darin, dass die Dissoziation durch einen Fusionsauslöser im Endosom (saurer pH-Wert) und/oder durch einen spezifischen zellulären Rezeptor erleichtert wird. In dieser Hinsicht könnten die FV-RBD-Schleifen eine Rolle spielen, die den V1/V2/V3-Schleifen in HIV Env entspricht, die für Konformationsflexibilität sorgen40,41. Es wird auch wichtig sein, gegebenenfalls die molekularen RBD-Determinanten zu erkennen, die die Membranfusion an der Plasmamembran steuern, wie sie von PFV verwendet wird, im Vergleich zu allen anderen FVs, die in den Endosomen fusionieren11.

Basierend auf der Fähigkeit von SU-verkürzten Varianten, an Zellen zu binden, haben Duda et al. definierte die RBD von PFV Env als eine Region, die die Reste 225–55518 umfasst (Reste 226–552 in Gorilla GII Env (Abb. S15a)). Innerhalb der vorgeschlagenen Region wurde festgestellt, dass das zentrale Segment für die Zellbindungsaktivität entbehrlich ist18. Dieses Segment (auch RBDjoin42 genannt) umfasst die Schleifen L3 und L4, ist an der Spitze von RBD abgebildet und wird durch zwei Disulfidbindungen festgehalten (Abb. S5 und S15a). Seine Position, entfernt von den HS-bindenden Resten, steht im Einklang mit der Fähigkeit der PFV-SU-Verkürzung, der die äquivalente Region fehlt, in den für WT-Protein gemessenen Mengen an Zellen zu binden18. Das AF2-Modell der PFV-RBD, der die RBDjoin-Region fehlt, zeigt tatsächlich eine 3D-Faltung, die der der vollständigen RBD sehr ähnlich ist (Abb. S15b). Im Gegensatz dazu zeigen wir, dass die Deletionen der Schleifen L2 und L4 – im Kontext des trimeren GII-Env – einen tiefgreifenden Einfluss auf die Infektiosität haben, was das unterschiedliche Verhalten eines löslichen RBD und von RBDs innerhalb des Env-Trimers voller Länge hervorhebt.

Unsere Daten zeigen, dass K342/R343 und R356/R369 die Schlüsselreste für die RBD-Wechselwirkung mit HS sind, das auf einer inerten Matrix immobilisiert oder auf Zellen exprimiert ist (Abb. 6) und dass HS ein Bindungsfaktor für Gorilla-FV ist, was eine Erweiterung früherer Berichte darstellt für PFV17. Das rekombinante SFV GII RBD mit den 4 Mutationen (K342A, R343A, R356A und R369A) hatte sehr geringe Expressionsausbeuten, band aber erwartungsgemäß nicht an die Heparinsäule. In SFV-Envs ist der Rest an Position äquivalent zu 343 in Gorilla-GII-Env immer ein Arginin oder Lysin, während Arginin an Position 356 streng konserviert ist (Abb. S6). Reste an den Positionen 342 und 369 sind bei FV-Envs weniger konserviert, obwohl sie normalerweise von positiven oder polaren Resten umgeben sind. Dies deutet darauf hin, dass R343 und R356 für die HS-Bindung in allen FVs wichtig sein könnten, während andere positiv geladene Reste, die für jedes Virus spezifisch sind und sich an anderer Stelle innerhalb des Pflasters mit hohem positivem elektrostatischem Potenzial befinden, zur HS-Bindung in einem virusspezifischen Virus beitragen könnten Kontext (Abb. 5a).

Die Existenz eines FV-Rezeptors wurde von Plochmann et al. vorgeschlagen. da ein völliger Mangel an HS die FV-Infektion nicht beseitigte, wurde jedoch auch vorgeschlagen, dass HS als echter FV-Rezeptor fungiert16. Die verbleibende Env-Bindung an Zellen ohne HS, die wir sowohl für die WT- als auch für die HS-bindungsgestörten Varianten beobachteten (Abb. 6d), steht im Einklang mit dem Vorhandensein zusätzlicher Zellrezeptoren beim FV-Eintritt. Die von uns generierten Env-Varianten mit defekter HS-Bindung werden nützliche Werkzeuge bei der Suche nach potenziellen Proteinrezeptoren sein, da sie die Bindung an HS, einen weit verbreiteten Bindungsfaktor, eliminieren.

Der hohe Korrelationskoeffizient, den wir für die Anpassung der GII-RBD-Röntgenstruktur in die PFV-Env-EM-Karte erhalten haben, deutet stark darauf hin, dass die allgemeine Position der RBD-Schleifen in unserem trimeren Modell gültig ist. Die von ihnen hergestellten Kontaktreste und Wechselwirkungen können jedoch nicht genau abgeleitet werden, da wir die GII-RBD-Kristallstruktur in eine Kryo-EM-Karte eingepasst haben, die für ein anderes Virus (PFV) mit niedriger Auflösung (9 Å) erhalten wurde, was die Verfeinerung der Seitenketten ausschließt . Darüber hinaus weisen alle RBD-Schleifen hohe B-Faktoren auf (Abb. S2) und 7 Reste konnten in L3 nicht aufgebaut werden. Da AF2 den Resten in den Schleifen anderer FV-RBDs niedrige pLTTD-Werte zuordnete, war die Identifizierung der Kontaktreste an ihren RBD-Schnittstellen ebenfalls nicht möglich.

Unsere Daten deuten darauf hin, dass L2 und L4 für die Env-Aktivität beim Eintritt wichtig sind, liefern jedoch keinen direkten Beweis für die Ableitung der Bedeutung dieser Regionen für die Stabilität und Vorfusionskonformation des Env. Da wir die Anpassung in der Karte mit niedriger Auflösung durchgeführt haben, können wir auch die Möglichkeit nicht ausschließen, dass RBDs – im Kontext des Env-Trimers – unterschiedliche Offenheitsgrade annehmen können, ähnlich wie gp120 in HIV-Env43. Die endgültige Identifizierung der RBD-Schnittstellen innerhalb des Env und ihrer Rolle bei der Konformationsstabilisierung vor der Fusion erfordert eine atomare Auflösungsstruktur des Env-Trimers voller Länge. Wir haben versucht, die Struktur des trimeren Volllängen-Env durch AF2 vorherzusagen, aber der Versuch war aufgrund der großen Größe des Env-Protomers (fast 1000 Reste) und der Rechenbeschränkungen des Servers, auf den wir Zugriff haben, nicht erfolgreich.

In diesem Manuskript haben wir die erste Röntgenstruktur eines FV-RBD beschrieben und bestätigt, dass die neuartige Faltung diejenige ist, die im nativen FV-Env übernommen wurde. Wir haben innerhalb der RBD zwei Subdomänen hinsichtlich ihrer Struktur, Konservierung und Funktion identifiziert: die obere Subdomäne, die den größten Teil der genotypspezifischen Region umfasst, und eine stärker konservierte untere Subdomäne, die für die Bindung an den Bindungsfaktor HS wichtig ist . Wir haben AF2-Modelle für 10 weitere FV-RBDs erstellt und dabei deren konservierte dreidimensionale Konformation hervorgehoben. Diese Informationen sind für das Verständnis der Virus-Zell-Interaktionen von entscheidender Bedeutung und haben einen Rahmen für strukturgesteuerte Mutagenesestudien bereitgestellt, die für die Etablierung der molekularen Grundlagen des FV-Eintritts und der FV-Erkennung durch neutralisierende Antikörper erforderlich sind, wie in Dynesen et al.42 beschrieben. Der AlphaFold24-Algorithmus kann die Anordnung von Oligosacchariden auf der Oberfläche von Glykoproteinen nicht vorhersagen. Die zuvor berichteten Funktionsbeobachtungen zu FV Envs sowie die Rolle von N8 können nun im Lichte der experimentell abgeleiteten Struktur verstanden werden, was die Notwendigkeit einer Strukturbestimmung mit experimentellen Mitteln unterstreicht. Die Identifizierung von HS-bindenden Resten wird die Suche nach weiteren mutmaßlichen FV-Rezeptoren unterstützen. Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehung des metastabilen, multimeren und stark glykosylierten FV Env sowie die Aufklärung der molekularen Grundlagen der Rezeptoraktivierung und Membranfusion erfordern integrierte biologische Anstrengungen und experimentelle Strukturmethoden.

Ein Durchflusszytometrie-Assay wurde von Duda et al. entwickelt. um die Bindung rekombinant exprimierter Env-Varianten des Foamy-Virus an Zellen nachzuweisen18. Mithilfe einer Reihe von SU-Verkürzungen, die mit der Fc-Region von murinem IgG (Immunadhäsinen) fusioniert waren, zeigten die Autoren, dass die RBD – definiert als die minimale Region des PFV-Env, die für die Bindung an Zellen ausreicht – die Reste 225 bis 555 (entsprechend den Resten 226) umfasste bis 552 im Gorilla FV RBD (GII-K74-Stamm, Zugangsnummer JQ867464)44 (Abb. S6)). Beim Entwerfen des Ausdruckskonstrukts für SFV RBD haben wir auch die vom Phyre2-Webserver45 generierte sekundäre Vorhersage berücksichtigt. Der Rest I225 befand sich in der Mitte einer mutmaßlichen Helix (Reste 220–230), was uns dazu veranlasste, einen stromaufwärts gelegenen Rest R218 als N-Terminus des Konstrukts zu wählen (Abb. 1a und Abb. S6).

Die vom Phyre2-Webserver erhaltenen Informationen zu Sekundärstrukturvorhersagen wurden auch zum Entwurf des Env-Ektodomänenkonstrukts verwendet, das nach der ersten vorhergesagten Transmembranhelix (S91) beginnt und Reste bis I905 umfasst.

Für Strukturstudien wurde das RBD (Reste 218–552, GII-K74-Stamm, Env-Zugangsnummer JQ867464) in ein modifiziertes pMT/BiP-Insektenzellen-Expressionsplasmid (Invitrogen) mit der Bezeichnung pT350 kloniert, das einen durch zweiwertige Kationen induzierbaren Metallothionein-Promotor enthält. das BiP-Signalpeptid am N-Terminus (MKLCILLAVVAFVGLSLG) und ein Doppel-Strep-Tag (DST) (AGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK) am C-Terminus46. Dieses Plasmid wurde in Zellen der Linie 2 von Drosophila Schneider (S2) mit dem pCoPuro-Plasmid zur Puromycin-Selektion co-transfiziert47. Die Zelllinie wurde einer Selektion in serumfreiem Insektenzellmedium (HyClone, GE Healthcare) unterzogen, das 7 μg/ml Puromycin und 1 % Penicillin/Streptomycin enthielt. Für die Proteinproduktionsphase wurden die Zellen in Spinnerflaschen gezüchtet, bis die Dichte ~1 × 107 Zellen/ml erreichte. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Proteinexpression mit 4 μM CdCl2 induziert. Nach 6 Tagen wurden die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt, der Überstand konzentriert und zur Affinitätsreinigung unter Verwendung einer StrepTactin-Säule (IBA) verwendet. Pro Liter S2-Zellkultur wurden etwa 20 Milligramm rekombinantes RBD erhalten. Das DST wurde durch Inkubation des Proteins mit 64 Einheiten der leichten Enterokinase-Kette (BioLabs) in 10 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH 8,0, bei Raumtemperatur über Nacht entfernt. Die Proteolysereaktion wurde in 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0, gepuffert und einer weiteren Affinitätsreinigung unterzogen, wobei die Durchflussfraktion mit dem nicht markierten RBD gewonnen wurde. Das Protein wurde konzentriert und seine enzymatische Deglykosylierung mit EndoD und EndoH wurde bei Raumtemperatur nach einer Inkubation über Nacht mit 1000 Einheiten jeder Glykosidase in 50 mM Na-Acetat, 200 mM NaCl, pH 5,5, eingeleitet. Das Protein wurde auf einer Größenausschlusschromatographie (SEC)-Säule Superdex 200 16/60 (Cytiva) in 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0 weiter gereinigt, in VivaSpin-Konzentratoren auf 8,2 mg/ml konzentriert und als solches für Kristallisationsversuche verwendet .

Für Zellbindungsexperimente wurde das RBD-Konstrukt in ein von pcDNA3.1(+) abgeleitetes Plasmid zur Expression in Säugetierzellen kloniert. Das Expressionsplasmid wurde durch Einfügen einer CMV-Exon-Intron-Exon-Sequenz modifiziert, die die Expression rekombinanter Proteine ​​erhöht. Das RBD wurde stromabwärts des CD5-Signalpeptids (MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG) mit einer Enterokinase-Spaltungsstelle und einem DST-Tag im C-Terminus kloniert. Die HS-Mutanten wurden durch ortsspezifische Mutagenese erzeugt. Die für die rekombinanten Proteine ​​kodierenden Plasmide wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers vorübergehend in Expi293FTM-Zellen (Thermo Fischer) mit FectroPRO® DNA-Transfektionsreagenz (Polyplus) transfiziert. Die Zellen wurden 5 Tage lang bei 37 °C inkubiert, danach wurden die Kulturen zentrifugiert. Das Protein wurde aus den Überständen durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer StrepTactin-Säule (IBA) gereinigt, gefolgt von SEC auf einer Superdex 200 10/300-Säule (Cytiva), äquilibriert in 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Der dem Monomerprotein entsprechende Peak wurde konzentriert und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Die WT-Gorilla-GII-FV-Ektodomäne wurde in den pT350-Vektor kloniert und als Matrize für die Erzeugung der Heparansulfat-bindenden Mutanten durch ortsgerichtete Mutagenese verwendet. Drosophila-S2-Zellen wurden wie oben beschrieben stabil mit den Vektoren transfiziert. Die Expression der Ektodomänen folgte den gleichen Schritten wie für die RBD-Produktion und nach 6 Tagen wurden sie aus den Zellüberständen durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer StrepTactin-Säule (IBA) und SEC auf einer Superose 6 10/300-Säule (Cytiva) in 10 mM Tris gereinigt , 100 mM NaCl, pH 8,0. Die Fraktionen innerhalb des Peaks, die der trimeren Ektodomäne entsprechen, wurden in VivaSpin-Konzentratoren konzentriert und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Kristallisationsversuche wurden in sitzenden Tropfen von 200 Nanolitern durchgeführt, die durch Mischen gleicher Volumina des Proteins und der Reservoirlösung im Format von 96 Greiner-Platten unter Verwendung eines Mosquito-Roboters gebildet wurden. Das Aussehen und das Wachstum der Kristalle wurden von einem Rock-Imager in der Core Facility for Protein Crystallization am Institut Pasteur in Paris, Frankreich, überwacht48. Der für die Datenerfassung verwendete native RBDD-Kristall wurde in 0,1 M Tris, pH 8,5, 3,5 M Natriumformiat (NaCOOH) gezüchtet. Für die abgeleiteten Daten wurde der RBDD-Kristall, gezüchtet in 0,1 M Tris, pH 8,5, 3,25 M Natriumformiat, über Nacht in derselben Kristallisationslösung, ergänzt mit 0,5 M Natriumiodid, eingeweicht und direkt eingefroren, wobei die Mutterlauge mit 33 % Ethylenglykol als Kryolösung verwendet wurde -Puffer. Die RBDG-Kristalle wurden aus einer Lösung erhalten, die 0,2 M Ammoniumtartarat ((NH4)2 C4H4O6) und 20 % w/v PEG 3350 enthielt.

Die Röntgenbeugungsdaten wurden an der Synchrotronquelle SOLEIL (Saint Aubin, Frankreich) gesammelt. Die nativen Daten für RBDD und RBDG wurden bei 100 K an der Proxima-149-Strahllinie bei einer Wellenlänge von 0,9786 Å gesammelt, während die abgeleiteten (jodgetränkten) Daten für RBDD bei Proxima-2A bei einer Wellenlänge von 1,907 Å gesammelt wurden. Die Strahllinien sind mit den Detektoren Pilatus Eiger X 16 M bzw. Eiger X 9 M (Dectris) ausgestattet.

Wir erhielten trigonale Kristalle, Raumgruppe 3221 für das RBDD (2,57 Å), P3121 (später als P3221 identifiziert) für das Derivat RBDD (3,2 Å) und hexagonale Kristalle für das RBDG-Protein (2,8 Å, Raumgruppe P61). Beugungsdaten wurden mit XDS50 verarbeitet und mit AIMLESS51 skaliert und zusammengeführt. Der hochauflösende Cut-off basierte auf dem statistischen Indikator CC1/252. Während der gesamten Verarbeitung wurden mehrere Anwendungen aus der CCP4-Suite verwendet53. Die Statistiken sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Die Phasen wurden experimentell durch anomale Beugung bei einer Wellenlänge bestimmt. Die AutoSol-Pipeline aus der Phenix-Suite54,55 wurde verwendet, wobei der anomale Datensatz verwendet wurde, um nach Jodstellen zu suchen und zwei NCS-Kopien in der asymmetrischen Einheit (ASU) zu spezifizieren. AutoSol hat die aus 20 Jodstellen bestehende Unterstruktur zuverlässig bestimmt. Die verfeinerten anomalen Phasen wurden intern verwendet, um das gesamte Protein mithilfe einer Dichtemodifikation in Phasen zu unterteilen. Das Ergebnis des Prozesses war eine Struktur mit einem niedrigen R-Faktor; Darüber hinaus zeigte die dichtemodifizierte Karte einen guten Kontrast zwischen dem Protein und dem Lösungsmittel und deutlich erkennbare helikale Merkmale. Die anfängliche Zuordnung der Raumgruppe der anomalen Daten war vorläufig, da die in der Zelle vorhandene Schraubenachse zwei Alternativen zulässt (P3121 oder P3221). Die enantiomorphe Mehrdeutigkeit wurde nach der Dichtemodifikation mit den anomalen Phasen und der Modellerstellung durch Betrachtung der Karte und ihrer Qualität gelöst. AutoSol hat eindeutig die richtige Raumgruppe ausgewählt, nämlich P3221. Die Struktur wurde in Buccaneer56 im Modus „Experimentelle Phasen“ unter Verwendung der dichtemodifizierten Karte von AutoSol und der verfeinerten Unterstruktur von AutoSol weiter verbessert. Schließlich wurde das BUCCANEER-Modell anhand der nativen Daten bei 2,57 Å durch iterative Runden von phenix.refine54, BUSTER57,58 und Coot59 verfeinert, die während der gesamten Modellerstellung und -verfeinerung zur Überprüfung und manuellen Korrektur des Modells verwendet wurden.

Um die Struktur des RBDG zu lösen, wurde die RBDD-Struktur als Suchmodell in Molecular Replacement in Phaser60 aus der Phenix-Suite verwendet. In diesem Fall wurde festgestellt, dass die ASU zwei Moleküle enthielt, die erneut mit einer Kombination aus BUSTER und phenix.refine verfeinert wurden.

Für beide Modelle wurden die 2Fo-Fc- und Fo-Fc-Elektronendichtedifferenzkarten verwendet, um die Kohlenhydrateinheiten eindeutig zu identifizieren und sie aufzubauen. Für beide Modelle wurde die endgültige Stereochemie von MolProbity (http://molprobity.biochem.duke.edu/)61 bewertet.

Die endgültigen Karten zeigten eine klare, interpretierbare Elektronendichte, mit Ausnahme einer Region mit den Resten 420–426, die den Aufbau auf diesen 7 Aminosäuren ausschloss und auf die inhärente Flexibilität der Region hinweist. Die Atommodelle wurden für die RBDD- und RBDG-Kristalle auf Rwork/Rfree von 0,21/0,25 und 0,19/0,23 verfeinert. Bei den Modellen RBDD und RBDG lagen 95,99 % bzw. 95,69 % der Residuen innerhalb der bevorzugten Region des Ramachandran-Diagramms und 0,31 % bzw. null Ausreißer.

Die RBD-Anpassung wurde mit der Fit-in-Map-Funktion in Chimera suite29 unter Verwendung des RBDD-Modells (PDB: 8AEZ) und der 8,8 Å EM-Karte (EMD-4013) durchgeführt, die für den PFV Env13 erhalten wurde. Die zur Anpassung verwendete Karte wurde aus Atomen mit einer Auflösung von 9 Å und Daten oberhalb des Kartenkonturniveaus von 0,025 simuliert, was zu einem Korrelationskoeffizienten von 0,96 führte. Zur Erstellung von Abb. 4 wurde ein Konturwert von 0,014 gewählt, um die Dichte der meisten Glykane sichtbar zu machen.

Baby Hamster Kidney (BHK)−21-Zellen (ATCC-CLL-10) wurden in DMEM-Glutamax-5 % fötalem Rinderserum (FBS) (PAA Laboratories) kultiviert. HT1080-Zellen (ECACC 85111505) wurden in EMEM-10 % FBS, ergänzt mit 1x L-Glutamin und 1x nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), kultiviert. Menschliche embryonale Nieren-293T-Zellen (CRL-3216) wurden in DMEM-Glutamax-10 % FBS kultiviert.

Foamy-Virus-Isolate wurden gemäß der überarbeiteten Taxonomie22 benannt und für Gorilla- und Schimpansenstämme wurden Kurznamen verwendet19. Das vierkomponentige FVV-System (Plasmide pcoPG, pcoPP, pcoPE, pcu2MD9-BGAL (ein Transferplasmid, das für β-Galactosidase kodiert)) und das Gorilla-Env-Konstrukt, das Sequenzen aus dem zoonotischen GI-D468 (JQ867465) und GII-K74 (JQ867464) enthält ) env-Gene (EnvGI-SUGII) wurden beschrieben19,42. Kurz gesagt besteht das von uns verwendete Env-Konstrukt vom Genotyp II (EnvGI-SUGII19) aus SU vom GII-BAK74-Genotyp und LP und TM vom GI-Stamm BAD468, wobei die beiden letzteren zwischen GI und GII sehr konserviert sind.

Mutationen in der RBD-vorhergesagten Heparansulfat-Bindungsstelle (K342A/R343A und R356A/R369A) wurden in dieses Gorilla-Env-Plasmid eingeführt, das GII-Env in voller Länge enthält. Den Varianten Env ΔL2 und ΔL4 fehlten die Reste 278–293 bzw. 442–458, die durch Glycin-Linker ersetzt wurden (GGGG für ΔL2 und GG für ΔL4). FVVs wurden durch Cotransfektion von vier Plasmiden (gag:env:pol:transgene β-Galactosidase) in einem Verhältnis von 8:2:3:32 produziert. Drei Mikrogramm Gesamt-DNA und 8 μl Polyethylenimin (JetPEI, #101-10N, Polyplus, Ozyme) wurden zu 0,5 × 106 HEK 293T-Zellen gegeben, die in Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät wurden. Die Überstände wurden 48 Stunden nach der Transfektion gesammelt, 10 Minuten lang bei 1500 × g geklärt und als Einmal-Aliquots bei –80 ° C gelagert. Die Vektorinfektiosität wurde durch Transduktion von BHK-21-Zellen mit seriellen Fünffachverdünnungen von Vektoren und Nachweis der β-Galactosidase-Expression nach 72-stündiger Kultur bei 37 °C bestimmt. Die Platten wurden mit 0,5 % Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert, mit PBS gewaschen und mit 150 μl X-Gal-Lösung mit 2 mM MgCl2, 10 mM Kaliumferricyanid, 10 mM Kaliumferrocyanid und 0,8 gefärbt mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-BD-galactopyranosid in PBS für 3 Stunden bei 37 °C. Die Zählung erfolgte mit einem S6 Ultimate Image UV-Analysegerät (CTL Europe, Bonn, Deutschland), wobei eine blaue Zelle als eine infektiöse Einheit definiert wurde. Die Zelltransduktion durch FVV ist ein Ersatz für die virale Infektiosität und die FVV-Titer wurden als infektiöse Einheiten/ml ausgedrückt.

Die Ausbeute an FVV-Partikeln wurde durch Quantifizierung der partikelassoziierten Transgen-RNA geschätzt. FVV-RNAs wurden mit dem QIAamp Viral RNA Extraction Kit (Qiagen) aus rohen Zellüberständen extrahiert. RNAs wurden mit einem DNA-freien Kit (Life Technologies) behandelt und mit Maxima H Minus Reverse Transkriptase (Thermo Fischer Scientific) unter Verwendung von Zufallsprimern (Thermo Fischer Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers retrotranskribiert. qPCR wurde an cDNA unter Verwendung von BGAL-Primern (BGAL_F 5' AAACTCGCAAGCCGACTGAT 3' und BGAL_R 5' ATATCCGGCTCAGTTCGAG 3') mit einem 10-minütigen Denaturierungsschritt bei 95 °C und 40 Amplifikationszyklen (15 s bei 95 °C, 20 s bei 60 °C) durchgeführt C und 30 s bei 72 °C) durchgeführt mit einem Eppendorf realplex2 Mastercycler (Eppendorf). Zur Bestimmung der Kopienzahl der FVVs wurde eine Standardkurve verwendet, die mit Reihenverdünnungen des pcu2MD9-BGAL-Plasmids erstellt wurde. Die Ergebnisse wurden als Vektorpartikel/ml ausgedrückt, wobei berücksichtigt wurde, dass jedes Partikel 2 Kopien des Transgens trägt.

Der Server ClusPro (https://cluspro.org/login.php) wurde zur Identifizierung einer potenziellen Heparin-Bindungsstelle31,62,63,64 verwendet. Der Server generierte 13 Modelle eines vollständig sulfatierten Tetrasaccharid-Heparinfragments, das an die FV-RBD angedockt war, sowie eine Liste von Atom-Atom-Kontakten zwischen der Heparinkette und den Proteinresten, die zur Erstellung der Diagramme in Abb. 5b verwendet wurde.

Einhundert Mikrogramm rekombinante FV-RBDs (Wildtyp, R356A/R369A, K342A/R343A) wurden mit 1 ml/min auf eine Heparin-Sepharose-Säule (Cytiva) injiziert, die zuvor mit Laufpuffer (10 mM Tris, 100 mM NaCl) äquilibriert worden war , pH 8,0). Nach dem Waschen wurde ein linearer Gradient (von 0 bis 50 % über 30 Minuten) Elutionspuffer (10 mM Tris, 2 M NaCl, pH 8,0) angewendet.

Anhaftende HT1080- und BHK-21-Zellen wurden mit Trypsin-EDTA abgelöst und pro Bedingung wurden 5 × 105 Zellen verwendet. Zellwasch- und Färbeschritte wurden in PBS, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) bei 4 °C durchgeführt. SFV-Env-Ektodomänen wurden 1 Stunde lang zum Zellpellet gegeben. Die Zellen wurden zweimal gewaschen, mit StrepMAB-Classic-HRP-Antikörper, der den Strep-Tag am C-Terminus der SFV-Env-Ektodomäne erkennt (7,5 µg/ml, IBA Lifesciences Nr. 2-1509-001), 1 Stunde lang inkubiert, zweimal gewaschen und 30 Minuten lang mit dem an den Fluorophor AF488 gekoppelten Sekundärantikörper (Anti-HRP-AF488 (0,75 µg/ml, Jackson ImmunoResearch, #123-545-021)) inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und in PBS, 2 % PFA bei Raumtemperatur für 10 Minuten fixiert und bis zur Erfassung bei 4 °C gehalten. Mit einem CytoFLEX-Zytometer (Beckman Coulter) wurden mindestens 25.000 Zellen erfasst. Die Daten wurden mit der Kaluza-Software (Beckman Coulter) analysiert. Lebensfähige Einzelzellen wurden durch sequentielle Anwendung von Gates auf FSC-A/SSC-A- und SSC-A/SSC-H-Punktdiagrammen ausgewählt (Abb. S13a). Als Referenz dienten nur mit den beiden Sekundärantikörpern markierte Zellen. Die SFV-Env-Bindung wurde als Verhältnis der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) der Zellen, die mit den rekombinanten Ektodomänen inkubiert wurden, im Vergleich zu unbehandelten Zellen ausgedrückt (Abb. S13b).

Die Zellen wurden mit Trypsin-EDTA behandelt und 5 × 105 Zellen pro Bedingung markiert. Die Zellen wurden einmal mit PBS, 0,1 % BSA gewaschen, bevor sie mit 0,1 mIU/ml Heparinase III aus Flavobacterium heparinum (Sigma-Aldrich, #H8891) in 20 mM Tris, 0,1 mg/ml BSA und 4 mM CaCl2, pH 7,45 für 15 Minuten inkubiert wurden Mindest. bei 37 °C. Heparansulfat wurde durch Anfärben mit F58-10E4-Antikörper (5 µg/ml, AmsBio, UK #370255-S) und Anti-Maus-IgM-AF488-Antikörpern (2 µg/ml, Invitrogen #A-21042) nachgewiesen. Das durch HS-Entfernung erzeugte Neoantigen (ΔHS) wurde mit dem F69-3G10-Antikörper (10 µg/ml, AmsBio #370260-S) und den Anti-mIgG-AF647-Antikörpern (4 µg/ml, Invitrogen #A-31571) nachgewiesen. Die Zellfärbung und das Waschen wurden in PBS, 0,1 % BSA bei 4 °C durchgeführt. Die Inkubationszeiten betrugen 60 bzw. 30 Minuten für primäre und sekundäre Antikörper. Die Zytometererfassung und Datenanalyse wurden wie für die Env-Bindung beschrieben durchgeführt (Abb. S13). Als Referenz dienten ausschließlich mit Sekundärantikörpern markierte Zellen. Die Niveaus der HS- und ΔHS-Färbung wurden als Verhältnis von MFI von markierten zu unmarkierten Zellen ausgedrückt (Abb. S13c).

HT1080-Zellen wurden mit FVV-Partikeln (1, 10 und 100 Partikel/Zelle) 1 Stunde lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, um ungebundene FVVs zu entfernen, und die RNAs wurden mit dem RNeasy plus Mini-Kit (Qiagen) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die RT wurde wie für die FVVs-RNA-Quantifizierung beschrieben durchgeführt. Gebundenes FVV wurde durch qPCR des bgal-Gens quantifiziert, wie für die Vektortitration beschrieben; Die Zellen wurden durch eine qPCR quantifiziert, die das hgapdh-Gen mit den folgenden Primern amplifizierte: hGAPDH_F 5' GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT 3' und hGAPDH_R 5' GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG 3'. Die qPCR-Reaktionsbedingungen waren die gleichen wie diejenigen, die zur Amplifikation des bgal-Gens verwendet wurden. Die relative mRNA-Expression von bgal gegenüber hgapdh wurde unter Verwendung der –ΔΔCt-Methode und die relative Bindung als 2–ΔΔCt berechnet.

Die infektiösen Titer, die Partikelkonzentration, der Prozentsatz infektiöser Partikel und die Menge an gebundenen FVVs, die WT und mutierte Envs tragen, wurden mithilfe des zweifachen gepaarten t-Tests verglichen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Daten, die sich auf die für SFV GII RBDD und RBDG ermittelten Röntgenstrukturen beziehen, wurden in der RCSB-Proteindatenbank unter den PDB-Zugangscodes 8AEZ bzw. 8AIC hinterlegt. Die AF2-Modelle von FV-RBDs wurden mit den folgenden Zugangscodes in der Datenbank des Modellarchivs hinterlegt: Gorilla (Genotyp II, Zugangscode: ma-5hiw1), Gorilla (Genotyp I; Zugangscode: ma-sln9b), Prototyp des Foamy-Virus (Schimpanse, Genotyp I; Zugangscode: ma-ogxjm), Westlicher Schimpanse (Genotyp I; Zugangscode: ma-zilao), Zentralafrikanischer Schimpanse (Genotyp II, Zugangscode: ma-u3aws), Afrikanische Grüne Meerkatze (Zugangscode: ma-mf4i2), Orang-Utan (Zugangscode: ma-kae1t), Makaken (Zugangscode: ma-eolif), Weißbüschelaffen (Zugangscode: ma-4q50y), Rind (Zugangscode: ma-ad22f), Pferd (Zugangscode: ma-iodkg) und Katze (Zugangscode: ma-ocsub). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Aiewsakun, P. & Katzourakis, A. Mariner Ursprung von Retroviren im frühen Paläozoikum. Nat. Komm. 8, 13954 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rethwilm, A. & Bodem, J. Evolution von Foamy-Viren: das älteste aller Retroviren. Viren 5, 2349–2374 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pinto-Santini, DM, Stenbak, CR & Linial, ML zoonotische Infektionen mit dem Foamy-Virus. Retrovirologie 14, 55 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Buseyne, F. et al. Klinische Anzeichen und Bluttestergebnisse bei Menschen, die mit dem zoonotischen Affenschaumvirus infiziert sind: eine Fall-Kontroll-Studie. Journal of Infectious Diseases 218, 144–151 (2018).

CAS PubMed Google Scholar

Ledesma-Feliciano, C. et al. Feline Foamy-Virus-Infektion: Charakterisierung experimenteller Infektionen und Prävalenz natürlicher Infektionen bei Hauskatzen mit und ohne chronischer Nierenerkrankung. Viren 11, 662 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meiering, CD & Linial, ML Historische Perspektive der Epidemiologie und Infektion des Foamy-Virus. Klin. Mikrobiol. Rev. 14, 165–176 (2001).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rajawat, YS, Humbert, O. & Kiem, H.-P. In-vivo-Gentherapie mit Foamy-Virus-Vektoren. Viren 11, 1091 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

White, JM & Whittaker, GR Fusion umhüllter Viren in Endosomen. Verkehr 17, 593–614 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Harrison, SC Virale Membranfusion. Virology 479–480, 498–507 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Picard-Maureau, M., Jarmy, G., Berg, A., Rethwilm, A. & Lindemann, D. Der durch Glykoproteine ​​vermittelte Eintritt in die schaumige Virushülle beinhaltet einen pH-abhängigen Fusionsprozess. J. Virol. 77, 4722–4730 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dupont, A. et al. Identifizierung eines Zwischenschritts bei der Foamy-Virus-Fusion. Viren 12, 1472 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rey, FA & Lok, SM Gemeinsame Merkmale behüllter Viren und Auswirkungen auf das Immunogendesign für Impfstoffe der nächsten Generation. Zelle 172, 1319–1334 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Effantin, G. et al. Kryo-Elektronenmikroskopie-Struktur des nativen Schaumvirus-Glykoprotein-Prototyps und der Virusarchitektur. PLoS Pathog. 12, e1005721 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilk, T. et al. Das intakte retrovirale Env-Glykoprotein des humanen Foamy-Virus ist ein Trimer. J. Virol. 74, 2885–2887 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pancera, M. et al. Struktur und Immunerkennung von trimerem Präfusions-HIV-1-Env. Natur 514, 455–461 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nasimuzzaman, M. & Persons, DA Zellmembran-assoziiertes Heparansulfat ist ein Rezeptor für den Prototyp des Foamy-Virus in Zellen von Menschen, Affen und Nagetieren. Mol. Dort. 20, 1158–1166 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Plochmann, K. et al. Heparansulfat ist ein Bindungsfaktor für den Eintritt von Foamy-Viren. J. Virol. 86, 10028–10035 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duda, A., Luftenegger, D., Pietschmann, T. & Lindemann, D. Charakterisierung des Prototyps der Glykoproteinrezeptor-Bindungsdomäne der Schaumvirushülle. J. Virol. 80, 8158–8167 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lambert, C. et al. Starke neutralisierende Antikörper bei Menschen, die mit zoonotischen Affenschaumviren infiziert sind, zielen auf konservierte Epitope ab, die sich in der dimorphen Domäne des Oberflächenhüllenproteins befinden. PLoS Pathog. 14, e1007293 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lambert, C. et al. Ein immundominantes und konserviertes B-Zell-Epitop in der Hülle des Affenschaumvirus, das von Menschen erkannt wird, die mit zoonotischen Stämmen von Affen infiziert sind. J. Virol. 93, e00068–19 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luftenegger, D., Picard-Maureau, M., Stanke, N., Rethwilm, A. & Lindemann, D. Analyse und Funktion der N-Glykosylierung der prototypischen schaumigen Virushülle. J. Virol. 79, 7664–7672 (2005).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Khan, AS et al. Spumaretroviren: aktualisierte Taxonomie und Nomenklatur. Virology 516, 158–164 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Holm, L. DALI und die Beständigkeit der Proteinform. Proteinwissenschaft. 29, 128–140 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jumper, J. et al. Hochpräzise Vorhersage der Proteinstruktur mit AlphaFold. Natur 596, 583–589 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aiewsakun, P. et al. Modularität der Genome des Affenschaumvirus und ihre Evolutionsgeschichte. Virusentwicklung. 5, vez032 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Richard, L. et al. Kozirkulation zweier env-Molekülvarianten möglicherweise rekombinanten Ursprungs in Gorilla- und Schimpansen-Simian-Foamy-Virus-Stämmen aus Zentralafrika. J. Virol. 89, 12480–12491 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. & Skolnick, J. Bewertungsfunktion zur automatisierten Bewertung der Qualität von Proteinstrukturvorlagen. Proteins 57, 702–710 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dong, R., Peng, Z., Zhang, Y. & Yang, J. mTM-align: ein Algorithmus für die schnelle und genaue Ausrichtung mehrerer Proteinstrukturen. Bioinformatik 34, 1719–1725 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera – ein Visualisierungssystem für explorative Forschung und Analyse. J. Comput. Chem. 25, 1605–1612 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Krissinel, E. & Henrick, K. Rückschluss auf makromolekulare Anordnungen aus dem kristallinen Zustand. J. Mol. Biol. 372, 774–797 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kozakov, D. et al. Der ClusPro-Webserver für Protein-Protein-Docking. Nat. Protokoll. 12, 255–278 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fass, D., Harrison, SC & Kim, PS Retrovirus-Hülldomäne bei 1,7 Angström Auflösung. Nat. Struktur. Biol. 3, 465–469 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fass, D. et al. Struktur eines murinen Leukämievirus-Rezeptor-bindenden Glykoproteins bei einer Auflösung von 2,0 Angström. Science 277, 1662–1666 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

McCarthy, KR et al. Struktur der Rezeptorbindungsdomäne von EnvP(b)1, einem endogenen retroviralen Hüllprotein, das in menschlichen Geweben exprimiert wird. mBio 11, e02772–20 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kwong, PD et al. Struktur eines HIV-gp120-Hüllglykoproteins im Komplex mit dem CD4-Rezeptor und einem neutralisierenden menschlichen Antikörper. Nature 393, 648–659 (1998).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindemann, D., Hutter, S., Wei, G. & Lochelt, M. Das Einzigartige, das Bekannte und das Unbekannte der Spumaretrovirus-Assemblierung. Viren 13, 105 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rethwilm, A. Die Replikationsstrategie von Foamy-Viren. Curr. Spitze. Mikrobiol. Immunol. 277, 1–26 (2003).

CAS PubMed Google Scholar

Battini, JL, Heard, JM & Danos, O. Determinanten der Rezeptorwahl in den Hüllglykoproteinen amphotroper, xenotroper und polytroper muriner Leukämieviren. J. Virol. 66, 1468–1475 (1992).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, B. Molekularer Mechanismus des HIV-1-Eintritts. Trends Mikrobiol. 27, 878–891 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, H. et al. Die Kryo-EM-Struktur eines CD4-gebundenen Trimers mit offener HIV-1-Hülle zeigt strukturelle Umlagerungen der gp120-V1V2-Schleife. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 113, E7151–E7158 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burton, DR & Hangartner, L. Breit neutralisierende Antikörper gegen HIV und ihre Rolle bei der Impfstoffentwicklung. Annu. Rev. Immunol. 34, 635–659 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dynesen, LT et al. Neutralisierung zoonotischer Affenschaumviren: genotypspezifische Epitope innerhalb der Rezeptorbindungsdomäne. https://doi.org/10.1101/2022.11.06.515319 (2022).

Burton, DR, Poignard, P., Stanfield, RL & Wilson, IA Breit neutralisierende Antikörper bieten neue Möglichkeiten, Viren mit hoher Antigenvielfalt entgegenzuwirken. Wissenschaft 337, 183–186 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rua, R., Betsem, E., Calattini, S., Saib, A. & Gessain, A. Genetische Charakterisierung von Affenschaumviren, die Menschen infizieren. J. Virol. 86, 13350–13359 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kelley, LA, Mezulis, S., Yates, CM, Wass, MN & Sternberg, MJ Das Phyre2-Webportal für Proteinmodellierung, -vorhersage und -analyse. Nat. Protokoll. 10, 845–858 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krey, T. et al. Die Disulfidbindungen im Glykoprotein E2 des Hepatitis-C-Virus offenbaren die tertiäre Organisation des Moleküls. PLoS Pathog. 6, e1000762 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Backovic, M. & Krey, T. Stabile Drosophila-Zelllinien: ein alternativer Ansatz zur exogenen Proteinexpression. Methoden Mol. Biol. 1350, 349–358 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Weber, P. et al. Hochdurchsatz-Kristallisationspipeline in der Kristallographie-Kernanlage des Institut Pasteur. Molecules 24, 4451 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chavas, LMG et al. PROXIMA-1-Strahllinie für makromolekulare Kristallographiemessungen am Synchrotron SOLEIL. J. Synchrotronstrahlung. 28, 970–976 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 66, 125–132 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Evans, PR & Murshudov, GN Wie gut sind meine Daten und wie hoch ist die Auflösung? Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 69, 1204–1214 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Karplus, PA & Diederichs, K. Verknüpfung von kristallographischem Modell und Datenqualität. Wissenschaft 336, 1030–1033 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Winn, MD et al. Überblick über die CCP4-Suite und aktuelle Entwicklungen. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 67, 235–242 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX: ein umfassendes Python-basiertes System zur Lösung makromolekularer Strukturen. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 66, 213–221 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Terwilliger, TC et al. Entscheidungsfindung bei Strukturlösungen mithilfe von Bayes'schen Schätzungen der Kartenqualität: der PHENIX AutoSol-Assistent. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 65, 582–601 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cowtan, K. Die Buccaneer-Software für den automatisierten Modellbau. 1. Proteinketten aufspüren. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 62, 1002–1011 (2006).

Artikel PubMed Google Scholar

Blanc, E. et al. Verfeinerung stark unvollständiger Strukturen mit maximaler Wahrscheinlichkeit in BUSTER-TNT. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 60, 2210–2221 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bricogne, G. et al. BUSTER. 2.8.0 edn (Global Phasing Ltd., Cambridge, 2009).

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: Modellbauwerkzeuge für molekulare Grafiken. Acta Crystallogr. D Biol Crystallogr. 60, 2126–2132 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

McCoy, AJ et al. Phaser-Kristallographiesoftware. J Appl Crystallogr. 40, 658–674 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, VB et al. MolProbity: Validierung der Gesamtatomstruktur für die makromolekulare Kristallographie. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 66, 12–21 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mottarella, SE et al. Docking-Server zur Identifizierung von Heparin-Bindungsstellen auf Proteinen. J. Chem. Inf. Modell 54, 2068–2078 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vajda, S. et al. Neuzugänge auf dem ClusPro-Server motiviert durch CAPRI. Proteine ​​85, 435–444 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Desta, IT, Porter, KA, Xia, B., Kozakov, D. & Vajda, S. Leistung und ihre Grenzen beim Protein-Protein-Docking von starren Körpern. Struktur 28, 1071–1081 (2020).e3.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DeLano, WL Das molekulare Grafiksystem PyMOL. (DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA, 2002).

Kyte, J. & Doolittle, RF Eine einfache Methode zur Darstellung des hydropathischen Charakters eines Proteins. J. Mol. Biol. 157, 105–132 (1982).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jurrus, E. et al. Verbesserungen an der APBS-Softwaresuite zur biomolekularen Solvatisierung. Proteinwissenschaft. 27, 112–128 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von der „Agence Nationale de la Recherche“ (ANR-10-LABX62-IBEID, Intra-Labex Grant, MB), dem „Programme de recherche transversal from Institut Pasteur“ (PTR2020-353 ZOOFOAMENV, FB) und finanziert Wiederkehrende Finanzierung durch das Institut Pasteur (FAR, AG). Die Finanzierungsagenturen spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, der Generierung von Ergebnissen oder der Erstellung des Manuskripts. Wir danken den Mitarbeitern der Utechs Cytometry & Biomarkers and Crystallography-Plattform am Institut Pasteur, der Synchrotronquelle SOLEIL (Saint-Aubin, Frankreich) für die Gewährung des Zugangs zur Einrichtung und den Mitarbeitern der Strahllinien Proxima 1 und Proxima 2A für ihre Freundlichkeit und Unterstützung bei der Röntgendatenerfassung. Wir danken Jan Hellert, Pablo Guardado-Calvo und Philippe Afonso für die Diskussionen und Ratschläge, insbesondere Max Baker für die Lektüre des Manuskripts und die Korrekturen in englischer Sprache.

Institut Pasteur, Universität Paris Cité, CNRS UMR3569, Abteilung für strukturelle Virologie, 75015, Paris, Frankreich

Ignatius Fernandez, Riccardo Pederzoli, Delphine Brun, Felix A. King und Marija Backovic

Institut Pasteur, Universität Paris Cité, CNRS UMR3569, Abteilung für Epidemiologie und Physiopathologie onkogener Viren, 75015, Paris, Frankreich

Lasse Toftdal Dynesen, Youna Coquin, Antoine Gessain und Florence Buseyne

Institut Pasteur, Universität Paris Cité, Crystallography-C2RT Platform, CNRS UMR 3528, 75015, Paris, Frankreich

Ahmed Haouz

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

MB und FB haben die Studie konzipiert und betreut. IF und LTD führten den Großteil der Experimente durch. IF kristallisierte die RBDs mit Hilfe von AH, sammelte die Röntgenbeugungsdaten, löste die Strukturen mit RP und führte die Bindungsstudien mit einer Heparin-Sepharose-Säule durch. LTD führte alle Bindungsstudien an den Zellen durch. YC produzierte und bewertete Foamy-Virus-Vektorpartikel in Infektionstests. Die DB leistete fortlaufend technische Hilfe. Der ursprüngliche Manuskriptentwurf wurde von MB verfasst, mit Beiträgen von IF, RP, LTD und YC, und die Überprüfung und Bearbeitung erfolgte durch MB, IF, LTD, FB und FAR. Die Finanzierung wurde von MB, FB, FAR, und AG

Korrespondenz mit Marija Backovic.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Wanhong Liu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Fernández, I., Dynesen, LT, Coquin, Y. et al. Die Kristallstruktur einer Rezeptorbindungsdomäne des Affen-Foamy-Virus liefert Hinweise auf den Eintritt in Wirtszellen. Nat Commun 14, 1262 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36923-0

Zitat herunterladen

Eingegangen: 30. September 2022

Angenommen: 21. Februar 2023

Veröffentlicht: 06. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36923-0

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.